一、重组质粒在大肠杆菌中的表达
1. 仪器耗材
紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml三角烧瓶、移液枪、枪头。
2. 试剂及配制
（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。
（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
3. 实验步骤
（1） 构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。
（2） 挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。
（3） 把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。
（4） 37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。
（5） 取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。
（6） 诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。
（7） 将不同诱导时间的菌样进行SDS-PAGE，分析蛋白的诱导表达情况。
（8） 确定诱导表达条件后，进行大量培养。
4. 注意事项
（1） 本实验步骤主要参考基于PET-28a构建的表达质粒。
（2） 必须确保诱导前细菌在1.5～3h内达到对数生长中期，故需要原始培养物的稀释浓度为1:100或者1:50，这是非常关键的。
（3） 诱导需要的温度、摇床转速、IPTG浓度，根据个人实验设计进行预试验确定最好的诱导条件，以达到最佳诱导表达效果。
（4） Kan的工作浓度一般为50-100μg/ml。
（5） 配制含Kan的LB平板时，当培养基温度高于60℃时加入Kan，会导致Kan活性降低。
（6） 配制抗生素长期保存应在-20℃，4℃可以保存数周。
（7） 保存数周的平板上细菌活性会降低，需重新划板培养。
参考文献
1．J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南（第3版）[M]．北
京：科学出版社，2002．1217-1232
2．J E．科林根等著，李慎涛等译．精编蛋白质科学实验指南[M]．北京：科学出版社，
2007．90-96，587
整理人：张振杰 审校人：周宏
二、蛋白质电泳
1．仪器与耗材
垂直电泳仪及其配件、10ml电动移液枪、各量程（0~10ul、10~100ul、100~1000ul）移液枪、染色盒、脱色盒、枪头、移液管、50ml烧杯
2．试剂及配制
2.1 30%丙烯酰胺：称取29g丙烯酰胺和1g N, N1-亚甲双丙烯酰胺溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。0.45um滤膜过滤后，测PH值。装于棕色瓶，保存于4℃.
须保证PH值低于7.0。禁止调PH值！
2.2 10%SDS: 称取10gSDS 溶于80ml超纯水中，然后定容至100ml。 室温保存。
因各厂家SDS质量相差较大，为避免不同品牌的SDS影响实验的一致性，建议每次配制使用同一品牌的SDS。
2.3 1.5M Tris-CL : 称取18.171g Tris-Base 溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调整PH值至8.8，然后定容至100ml，保存于4℃.
0.5M Tris-CL：称取6.057g Tris-Base 溶于80ml超纯水中，用浓盐酸调整PH值至6.8，然后定容至100ml，保存于4℃.
配制时务必确定用的是Tris-Base！调整PH值时用浓盐酸！
2.4 10% APS： 称取2.282g 过硫酸铵溶于8ml超纯水中，定容至10ml。
每0.5ml 分装保存于-20℃
若保存于4℃，则由于APS分解，两周后不再具有催化效果。
2.5 TEMED保存于4℃.
2.6 Running Buffer：称取3.03克 Tris-Base, 18.8g Glycine，5克SDS溶解定容至1000ml。 室温保存.
可以配制成10×贮存液。
2.7 1×SDS上样缓冲液： 0.05M Tris-HCL，100mM β-巯基乙醇，2% (m/V)SDS，0.1%(m/V) 溴酚蓝，10%(V/V)甘油. 注意：甘油的量取必须精确。
称取0.788g Tris-HCL, SDS 2g,溴酚蓝0.1g，量取5ml β-巯基乙醇10ml 甘油。溶解定容至100ml。
可以配制2×、4×上样缓冲液， 保存于4℃.
2.8 染色液：0.1% (m/V)考马斯亮蓝R-250，25%(V/V)甘油，10%(V/V)冰醋酸
称取0.5g考马斯亮蓝R-250，量取125ml甘油、50ml冰醋酸溶于300ml超纯水中，定容至500ml， 用化学滤纸过滤除去杂质，室温保存。
可重复利用，但随着使用次数增多，染色时间也要相应延长。
2.9 脱色液：10%(V/V)醋酸，5%(V/V)乙醇
量取100ml醋酸、50ml乙醇溶于800ml超纯水中，定容至1000ml。室温保存。
经活性炭处理后可重复利用，但随着使用次数增多，脱色时间也要相应延长。
2.10 负染染液：250mM KCL
称取18.64gKCL 溶于800ml 超纯水中，定容至1000ml。
室温保存。
2.11 不同浓度分离胶及5%积层胶配制：参见分子克隆P1716.
3．实验步骤
3.1 准备：用自来水清洗烧杯、电泳仪及其配件，然后四蒸水冲洗干净，晾干备用。
玻璃板先用自来水清洗干净擦干后用酒精棉球擦拭干净，自然晾干备用。
3.2 配胶：先组装好胶板，按照自己需要的分离胶浓度查找每种成分的使用的量及比例。在烧杯中依次加入超纯水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-CL、10%SDS、10% APS，最后添加TEMED。加入TEMED混合均匀后，立即用吸管加入胶板中(倒胶时，以梳子齿端为参照，预留1cm 积层胶空间)。然后，胶上加满蒸馏水封闭，以防蒸发。分离胶室温30min左右即可完全凝固。然后配制5%积层胶，烧杯中依次加入合适量的超纯水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-CL、10%SDS、10% APS，这时，先将分离胶上的超纯水倒掉，并用滤纸小心吸干残留水分，此时再将TEMED加入烧杯中，混合均匀立即用移液枪滴加到分离胶上，插入合适的梳子。积层胶20min左右可完全凝固。
胶的凝固时间与温度正相关，室温太低时，可放于37℃温箱促进凝固。
3.3 加样：小心拔掉梳子，组装好电泳仪。然后倒入1×Running Buffer, 务必使电泳液没过胶板内层的短板，胶板外可不必加满，但要没过电泳仪下方的电极线。
将蛋白Marker和处理好的样品按顺序加入胶孔，并做好记录。
3.4 跑胶：加样完毕即可跑胶，可固定电压进行跑胶。Bio-Rad电泳仪可固定在200V， 君 意电泳仪固定在150V，当染带刚刚跑出胶板时，跑胶完成。
跑胶时，若跑胶电压过高（≧150V）或室温过高（﹥25℃）时，应将电泳仪置于水浴或冰浴，以防玻璃板因温度过高或受热不均而破裂。
3.5 卸胶：小心拆卸胶板，用分离器小心将两层玻璃板分离，切去积层胶。
3.6 染色：将分离胶放于染色盒中，倒入20ml染色液，然后一起放在摇床上，慢慢摇动。染色20min即可。若染色液为多次利用，则适当延长时间。
3.7 脱色：将分离胶取出，放于脱色盒，倒入30ml脱色液，然后放在摇床上慢慢摇动过夜，或随时观察，直至分离胶除有蛋白的地方为蓝色其余部分变为无色即可。
3.8 分析并保存结果：将分离胶用四蒸水清洗干净，放于白板上，拍照保存。
3.9 其他情况：若要切胶收集蛋白，可用KCL负染。将分离胶置于染色盒，加入20ml 250mM KCL溶液即时显色，目的蛋白为微弱的乳白色，须仔细观察。
4．注意事项
4.1 配胶和拆胶过程中，小心操作，以防打碎玻璃板。若不慎打碎，须在记录本登记，并及时告知孙老师，以便即时采购，不影响他人实验。
4.2 切下的积层胶及用完的分离胶请扔入垃圾筐，不要倒入水池！！
4.3 因本实验部分试剂为有毒有害物质，所以需保护自身安全。并且在固定的操作区域进行，减少污染范围，以保护他人。
4.4 实验过程中需注意问题，参见本实验步骤。
参考文献
J.萨姆布鲁克， D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，第三版·1713-1720.科学技术出版社
整理人：张振杰 审校人：李娟
三、Ni柱纯化包涵体蛋白
1. 仪器及耗材
仪器：Ni柱，超声波破碎仪，漩涡振荡器，移液器
耗材：1.5ml离心管、1ml枪头
2. 试剂及配制
BufferB (100 mM NaH2PO4 ； 10 mM Tris•Cl ；8 M urea)
称NaH2PO4• 2H20 1.5601g；Tris•Cl 0.1576g；尿素 48.08g 放入250ml试剂瓶中，加入80ml四蒸水，用1M NaOH调PH至8.0，然后定容至100ml.
BufferC (100 mM NaH2PO4; 10 mM Tris•Cl；10mM Imidazole；8M urea )
称NaH2PO4• 2H20 1.5601g；Tris•Cl 0.1576g；咪唑0.058g；尿素 48.08g 放入250ml试剂瓶中，加入80ml四蒸水，用1M NaOH调PH至8.0，然后定容至100ml.
BufferE (100 mM NaH2PO4; 10 mM Tris•Cl；250mM Imidazole；8M urea)
称NaH2PO4• 2H20 1.5601g； Tris•Cl 0.1576g； 咪唑1.702g；尿素 48.08g，放入250ml试剂瓶中，加入80ml四蒸水，用1M NaOH调PH至8.0，然后定容至100ml.
6MGu•HCl、0.2M乙酸
称GuHCl 28.659g，用1ml枪吸572ul 冰乙酸，放入100ml试剂瓶中，用四蒸水定容至50ml。
100mM NiSO4
称NiSO4.6H2O 0.2629g 放入250ml试剂瓶中，加四蒸水定容至100ml。
2%SDS
称2g SDS 放入100ml试剂瓶，加四蒸水定容至100ml。
100mM EDTA (PH8.0)
称EDTA 2.9225g,放入250ml试剂瓶中，加入70ml四蒸水，用1M NaOH调至0.8，用四蒸水定容至100ml。
3. 实验步骤（针对6个组氨酸标签的包涵体蛋白纯化）
（1）样品的处理：
1.1 表达大肠杆菌液，5000rpm，10min，RT，弃上清，留沉淀；
1.2 用PBS(PH 7.2)重悬沉淀（7.5mlPBS/1ml沉淀）；
1.3 超声重悬液，工作时间1s，间隙时间3s，全程时间12min，总共180次；
1.4 12000rpm，10min，收集包涵体沉淀，弃上清；
1.5 用Buffer B溶解包涵体（7.5ml Buffer B/ml 沉淀），室温下孵育30~60min；
1.6 12000rpm，30min，弃沉淀，留上清作为样品A，样品A准备过柱。
（2）纯化步骤
2.1 NI Resin 的平衡：用Buffer B 洗柱子，直至流出液OD600 ≈0.00
2.2 将样品A 上柱，速度约1ml/min，柱子流出液为样品 B，留作跑胶。
2.3 用2倍柱体积的Buffer C 洗柱子，速度约1ml/min，至流出液OD280 ≤0.01，流出液样品 C，留作跑胶
2.4 用最小量的Buffer E 洗脱目的蛋白，速度约为1ml/min，至流出液OD280 ≤0.01，流出液为样品 D，以1.5ml离心管回收，1ml/管，留作跑胶；
（3）柱子的再生
3.1 2倍柱体积6M GuHCl,0.2M乙酸洗柱；
3.2 5倍柱体积的四蒸水洗柱；
3.3 3倍柱体积的2%SDS洗柱；
3.4 5倍柱体积的四蒸水洗柱；
3.5 5倍柱体积的无水乙醇洗柱；
3.6 5倍柱体积的四蒸水洗柱；
3.7 5倍柱体积的洗柱；
3.8 5倍柱体积的四蒸水洗柱；
3.9 5倍柱体积的100mM NiSO4 洗柱；
3.10 10倍体积的四蒸水洗柱。
4. 注意事项
(1) 本实验以南京金思特High-affinity NI-NTA Resin为例，其中所配制试剂均室温存放。
(2) 配制100mM EDTA(PH8.0)时候，很难溶解，必须将PH调至8.0时，EDTA才能完全溶解。
(3) 用BufferC和BufferE分别洗杂蛋白和目的蛋白时，流出液以1ml为一个单位存放在1.5ml离心管中，分别标记，跑胶时，对每管样品进行跑胶确定是否丢弃。
(4) 柱子再生后，将带有四蒸水柱子放入4℃存放，切记柱子不能干。
(5) 计算柱体积，柱体积=Ni树脂空隙体积，计算方法：当液体刚接触柱子液面时候，完全流出液体的体积。
(6) 金思特科技（南京）有限公司，Tel: 025-84347333，Fax:025-84347334， WebSite: www.jinsite.com.cn；代理：济南辰飞生物技术有限公司，Tel:0531-82315865，Fax:0531-82359680。
参考文献
1．J．萨姆布鲁克，D．W．拉塞尔著，黄培堂等译．分子克隆实验指南（第3版）[M]．北
京：科学出版社，2002．1217-1232
2．J E．科林根等著，李慎涛等译．精编蛋白质科学实验指南[M]．北京：科学出版社，
2007．275-279
3． 金思特High-affinity NI-NTA Resin说明书，Technical Manual No.0217，Version 20070418
整理人：李娟 审校人：周宏
四、电洗脱法纯化蛋白质
1. 仪器及耗材
仪器：电洗脱仪、伯乐电泳槽、伯乐电泳仪 、离心机 、移液枪
耗材：1ml枪头、200ul枪头
2. 试剂及配制
Protein Elution Buffer
称量Tris Base 3.0g，甘氨酸14.4g，SDS 1.0g，定容至1L，存于4℃，使用前如果有沉淀物，加热到37℃，使沉淀溶解后，再使用。
0.25M KCl
称量KCl 18.64g，用蒸馏水定容至1L，高压灭菌后，室温保存备用。
3. 实验步骤
（1） 切胶
将100ml表达菌液，8000rpm离心，将沉淀用6ml的上样缓冲液重悬，用1.5mm的玻璃板，将梳子用胶带粘成一条泳道，泳道内加入200ul重悬液，跑SDS-PAGE。结束后，将胶放入0.25M KCl 的溶液中，约2分钟，目的蛋白被染成一条白带，用刀片将这条目的条带切下，放入15ml离心管中，冻存在-20℃。
（2） 滤膜（membrane cap）处理
将滤膜浸泡在 60℃ 的Protein Elution Buffer中，至少1h。
（3） 安装电洗脱装置
3.1. 取出玻璃管和白色薄垫，将白色薄垫安置在玻璃管的底部（毛玻璃端）；
3.2 将滤膜安置在白色硅胶的接头的底部，然后向接头内加入Protein Elution Buffer，保证里面没有气泡；
3.3 将玻璃管（带有白色薄垫）慢慢旋入白色硅胶的接头内；
3.4 将玻璃管上部安装到洗脱装置上，放入电泳槽内；
3.5 电泳槽底部加入转子；
（4） 洗脱步骤
4.1 在电泳槽内加入600ml Protein Elution Buffer, 上端加入100ml Protein Elution Buffer。
4.2 慢慢将胶条（切碎，长度小于1cm）放入玻璃管中。
4.3 设置电泳仪，按8-10mA/玻璃管设置电流，设置好，开始洗脱，洗脱时间为3-5h，同时打开搅拌器。
4.4 电洗脱完毕后，将上面的100ml Protein Elution Buffer流入电泳槽底部，用枪将玻璃管内的Buffer 吸出弃掉。
4.5 按安装相反的顺序依次将仪器卸下，我们所要的样品在白色硅胶的接头中，将玻璃管和硅胶接头慢慢分开，用200ul枪取出样品，约有400ul，再用100ul的elution buffer 冲洗硅胶接头，防止丢失样品。
4. 注意事项
（1）滤膜必须经过处理后才能使用，滤膜的保存在含有叠氮钠的Protein elution buffer的液体中，4℃保存；
（2）电洗脱过程中，一直搅拌，防止滤膜下有气泡产生；
（3）洗脱完毕后，取出样品时，用枪吸出样品时，一定小心，防止戳破滤膜。
整理人：周宏 审校人：李娟
