BSL-2生物安全制度
泰山医学院病原生物研究所
生物安全二级实验室（BSL-2）
2015.10
1.尖锐器具安全操作规程
实验室内应尽量避免使用注射器、皮下注射针头等尖锐器具。如遇特殊需要，参照以下规程：
一、注射器、皮下注射针头等尖锐器具用过后不应重复使用，包括不能从注射器上取下、回套针头护套、截断等，应将其完整地置于盛放锐器地一次性容器中。单独使用或带针头使用的一次性注射器应放在盛放锐器地一次性容器内焚烧，如需要可先高压灭菌。
二、盛放锐器地一次性容器必须是不易刺破的，而且不能将容器装得过满。当达到容量的四分之三时，应将其放入“感染性废弃物”的容器中进行焚烧，如果实验室规程需要，可以先进行高压灭菌处理。盛放锐器的一次性容器绝对不能丢弃于垃圾场。
2. 危险废物处置安全操作规程
一、危险废物与一般固体废物和可回收废物应分类投入和存放，严禁混放混存。
二、液体危险废物（废油漆、废溶剂）等应存放于专用的桶装容器中，贮存、运送时必须采取有效的安全防范措施，防止发生泄漏和火灾事故。
三、固体危险废物（如电池、汞灯管、空容器罐、沾化学品抹布等）应分类、集中存放于专用包装容器内，并密闭。以防贮存、运送时泄漏、扩散、污染。
四、危险废物出厂时需标明名称、编号、类别、数量、日期及需要特别说明的内容。
五、长期存放危险废物的容器必须加盖，并密闭盖好。 六、盛装危险废物时，不得超过包装物或容器的3/4，应当使用有效的封口方式，使包装物或者容器的封口紧实、严密。
七、危险废物收集人员每天从各危险废物产生地点将分类好的危险废物按照规定的要求送至公司指定的暂存地点。
八、危险废物存放点、危险废物暂存初要有相关标识及严密的封闭措施，防止非工作人员接触危险废物。
九、一旦发生危险废物流失、泄漏、火灾等意外事故时，及时采取紧急措施，并启动应急方案，实施救援处理工作，同时上报相关负责人。
十、建立危险废物月统计登记，登记内容为日期、产生部门、危险废物种类、数量或重量，处置情况及相关人员签名，并保持记录备查。
十一、危险废物必须由具有资质的机构或环保部门指定单位接受公司行政部与之签订危废转移协议，并依照有关规定填写和保存废物转移联单。严禁有关人员私自转让、买卖危险废物。
十二、危险废物处置流程
产生废物者按要求对危险废物进行分类投放
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废物收集人员定期将部门内废物集中存放
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废物收集人员出厂前在包装物上填写标签内容
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填好危险废物转移联单
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危险废物运送到处置场所并缴纳危废处置费
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统计上报政府机构废物管理部门
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妥善保管第一联危险废物转移联单
个人防护设备使用规程
一、目的：规范个人防护用品的使用和穿戴以及脱卸。
二、 使用范围：生物安全二级实验室。
三、防护程序：
3.1个人防护用品
3.1.1实验服：在实验室工作时，任何时候都必须穿着实验服。
3.1.2口罩：在实验室工作时，任何时候都必须戴着口罩。
3.1.3帽子：在实验室工作时，任何时候都必须戴着帽子。
3.1.4手套：在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性材料的操作时，应戴上合适的手套。手套为一次性胶乳手套，必要时须戴两副，外层手套应根据需要及时更换。用过的一次性手套应丢入感染性废物袋内（贴有生物危险Ⅱ级标志的黄色垃圾袋）。手套用完摘除后必须洗手。
3.1.5其他防护：当有可能受到喷溅物污染、碰撞或人工紫外线辐射的伤害时，必须戴合适的安全眼镜。
3.1.6卸下个人防护装备的顺序按下面顺序进行：
3.1.6.1外层手套；
3.1.6.2面罩或护目镜；
3.1.6.3隔离衣；
3.1.6.4口罩或防护面具和防护帽；
3.1.6.5鞋套（可再戴新手套）；
3.1.6.6内层手套
3.1.7洗手：在处理完感染性材料后，以及在离开实验室前，都必须洗手（按规范步骤），纸巾擦干或烘干。
3.1.8不得穿着实验服离开实验室。
3.1.9不得在实验室内穿露脚趾的鞋子或渗液体的鞋类，应穿实验室专用鞋或使 用一次性鞋套。
3.1.10禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜等。
3.1.11禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。
3.1.12在实验室内用过的实验服不得和日常服装放在同一柜子内。
3.2实验室工作区
3.2.1实验室应保持清洁整齐，严禁摆放和实验无关的物品。
3.2.2 发生具有潜在危害性的材料溢出以及在每天工作结束之后，都必须清除工作台椅面、地面、物品面的污染。(台椅面、地面、物品均用含氯消毒速效泡腾片500mg/L擦洗,即1片泡腾片加水1L）。用75%酒精消毒生物安全柜台面。若活性物质溅出后要随时消毒，消毒剂为上述消毒片，但药液浓度扩大二倍，消毒时间必须长于15分钟。
3.2.3 所有受到污染的一次性材料应废弃于黄色的感染性废物袋内，生活垃圾应弃于黑色垃圾袋，不能混淆。
检测研究实验操作规程
一、对技术方法、化学品、材料与设备定期进行内部安全检查，确保其符合国家和地方的有关安全与卫生政策与标准。一旦发现不安全因素，立即停止工作并上报实验室负责人。
二、与有关人员讨论研究安全政策的问题；确认所有工作人员都具有进入实验室工作的资格；为所有人员提供连续性的安全要教育与指导。
三、针对操作程序、技术方法和各种条件要求的变更，以及新设备的引进，为全体工作人员提供最新的安全文献和信息资料。
四、定期检查实验室的各项技术参数，组织对实验室装备的常规保养。
五、所有可能涉及潜在传染性或有毒物质泄露的意外事件与事故，即使没有人员受伤或暴露，也要予以调查，并向实验室负责人员和安全委员会报告调查结果和提出建议。
六、当任何实验室工作人员的疾病或缺勤与工作有关，并被记录为可能的实验室获得性感染时，协助随访调查其疾病或缺勤情况。
七、确保在发生传染性物质溅洒其他事件时，监督消毒净化程序得到正确执行；并对这类意外事件和事故进行详细的书面记录。
八、确保任何需要修理和维护的仪器设备在消毒与净化之后方可运出实验室。
九、生物安全二级实验室，只允许进行实验室目的规定的操作，与此无关的活动一律不得进行；必须按规定进行个人防护，方得进入实验室。
十、保持实验室环境的整洁，每项工作完成之后，必须清理和清洁台面，离开实验室；注意个人的健康状况，出现身体不适情况，应及时向实验室负责人报告；实验室内禁止饮食、吸烟、访客和喧哗。
实验紧急情况处理规程
一、造成或可能造成实验室污染，但未造成人身伤害的实验室事故，由实验室负责人处理。例如实验过程中，由于标本、试剂溢出溅落造成操作台或地面的污染等，应立即喷洒消毒液并覆盖浸透消毒液的纸巾，等消毒液彻底浸泡30分钟后，对污染的物品进行处理。清理后的物品高压灭菌。并填写生物安全二级实验室意外情况登记与处理记录表，实验室负责人应指导这些处理行动，并检查处理效果。
二、在没有强毒微生物时，再实验室内受到意外伤害，例如割伤、烧伤、烫伤等，由实验室负责人处理。令受到伤害的人员立即停止工作，用消毒液清洗未破损的皮肤表面，伤口以碘伏消毒，眼睛用洗眼器反复冲洗。有在同一实验室内工作人员或派人迅速着装进入实验室，清除造成伤害的原因，清理实验材料，帮助受伤人员紧急处理并撤离实验室。受到伤害的人员应立即就医，并将受伤原因及接触微生物的情况通报负责人。对其进行恰当而完整的病史记录。在其身体状况未恢复之前，不得重新进入实验室工作。实验室在经过整理，消除了造成伤害的故障之后，方可重新使用。
三、伤害事故可能导致被强毒微生物感染，例如针头刺破、锐器割伤、粘膜暴露等途径接触到感染性液体，首先进行局部处理，用肥皂和水清洗污染的皮肤，挤压伤口尽可能挤出损伤处的血液，用肥皂或清水冲洗，用消毒液浸泡或涂抹消毒，并包扎伤口。在操作过程中发生培养物、污染材料溅落身体表面等情况，首先使用喷淋装臵，尽快将污染物冲洗掉，然后再进行局部处理。暴露的粘膜应尽快用生理盐水或清水冲洗干净。实验室负责人应向上级部门报告，对受伤害者进行隔离观察，同时根据情况预防性用药，并写出职业暴露后预防感染的评价和处理方案。
四、实验室事故可能造成气溶胶污染，如压力容器或管道破裂等，立即关闭实验室，疏散现场的所有人员，对所有暴露人员提出相应的医学建议。立即通知实验室负责人及生物安全员。至少在1小时内，任何人员不得进入现场，以便气溶胶的消散记空气中较重微粒的沉降。张贴禁止入内的警示标志。在生物安全员的监督下进行消毒、净化处理；执行这项工作时应当穿戴合适的防护服及呼吸防护用具。实验室负责人员除立即采取对应措施外，应向上级部门报告，填写意外情况登记与处理记录表。
五、被传染性物质物质污染的小玻璃瓶及其他容器破碎时，用布或纸巾覆盖，尔后将消毒剂倾倒其上，放臵30分钟。其后即可清除掉，玻璃碎片应当用镊子清理。污染区域应当用消毒剂清洗。破碎物品清理时如果使用了簸箕，应将其进行高压灭菌或用有效的消毒剂浸泡24小时。清理使用过的布、纸巾、抹布及拖把，放入污染废弃物容器中。上述步骤均应佩戴手套。
六、如果实验室的纪录表格、其他印刷品或书面材料遭到污染，在妥善转抄后或烤后，应当将其弃入污染废弃物容器。
七、所有密闭式安全离心杯在生物安全过程中装载和卸载。如果怀疑发生了破损，应当将其盖子拧松；尔后，将整个离心杯高压灭菌。
八、坚固、厚重的门、牢靠的锁具以及限制出入，都是合适的防范措施。发现蓄意破坏情况后报告实验室负责人及生物安全员，视破坏种类按照上述方法进行处理，并详细填写意外情况登记与处理记录表。
实验室生物安全标准操作规程
一、生物安全实验室个人防护规程
在生物安全实验室工作时必须穿着所提供的工作服。离开实验室时，工作服须挂在指定地方，不得在实验室外冼工作服。使用合适的个人防护装备，在离开实验室前必须脱掉并洗手。
二、生物安全标准个人行为
1.在实验室工作区禁止吸烟。
2.禁止在实验室放置食物、饮料及类似的存在有潜在的从手到口的接触途径的其他物质。禁止用实验室的冰箱（柜）储存食物。
3.处理腐蚀性或毒性物质时必须做好防护工作。应使用安全镜、面罩或其他的眼睛和面部防护用品。
4.在实验室工作区，污染区应穿白大衣或隔离衣，服装应符合实验室设备的要求。
5.应穿着舒适，防滑并能保护整个脚面的鞋子。
6.在实验工作区头发不可下垂，避免与污染物质接触或影响实验操作，有此类危险的饰物应避免带入工作区。不可留长胡须。
7.由实验工作区进入非污染区要洗手，接触污染物后要立即洗手。
8.实验室禁止堆积过多的垃圾，至少应每日清理一次。
9.禁止在实验工作区存放个人物品。
10.在实验室指定清洁区和非清洁区，非本室工作人员禁止进入工作区。
11.从移液器吸取液体、禁止口吸。
12.按照实验室安全规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。
13.每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时消毒。
14.需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。
15.生活垃圾和医用垃圾一定要分开装放。
16.无论何时都应尽可能避免使用注射器，针头或其它锐器。
17.使用过的针头和一次性切割器必须丢入专门的带有盖子和桶内，以备安全处理、防止容器过满盛装，使用过的针头不许重新使用或再用手操作。
18.打烂的玻璃必须放入坚硬的容器（不要用手），然后再放入垃圾袋。
三、实验室入口贴有生物危险标志，内部显著位置须贴上有关的生物危险信息，注明危险因子，生物安全级别，负责人姓名。
四、禁止非工作人员人进入实验室，或必须经实验室负责人同意后方可进入。
实验室消毒规程
一、目的：规范实验室操作人员的消毒灭菌过程。
二、适用范围：生物安全二级实验室。
三、生物安全实验室的消毒灭菌特点与要求
3.1 生物安全实验室的核心是“安全”，包括人身、安全、环境安全、废弃物安全、样本安全等。采取安全有效的消毒灭菌措施是实验室生物安全的重要保障，贯穿整个实验过程以及实验结束。对于生物安全实验室来说，消毒灭菌有以下特点:
3.1.1消毒对象种类多：包括实验室内部环境、地面、物体表面、墙壁、空气等) 、实验室一般实验器材( 玻璃器材、塑料、橡胶、无纺布制品、贵重仪器、纸张等) 、实验室人员( 人体及防护用品) 、实验室生物安全柜、隔离器、实验样本、感染性废弃物( 被感染性实验材料污染的实验用品以及废弃的感染性实验样本、培养液、培养基、鸡胚等) 。
3.1.2影响消毒效果的因素多。应综合考虑病原体抵抗力、传播方式、消毒因子、消毒对象、消毒环境、消毒时间以及实施过程的影响。
3.1.3消毒效果的最终确认需要较长的时间。
3.1.4各种消毒措施实施前需要进行验证评估。
3.2对于生物安全实验室，开展消毒灭菌的质量管理十分必要。
3.2.1 质量管理应该包括以下内容: 制定一个好的消毒灭菌程序或方案。一般来说，方案应包括以下内容:
3.2.1.1 明确消毒灭菌的目的，即保护工作人员健康，保证实验正常进行，避免污染环境等。
3.2.1.2确定对象和目标微生物，对可能的污染物品与对象均应进行消毒处理，同时应考虑对实验微生物的有效性.
3.2.1.3明确消毒灭菌的时机，考虑及时性与可操作性比如在实验前应开展对实验仪器、耗材等的消毒，以保证实验结果;实验过程中应开展对操作对象的消毒，以保护操作者; 实验结束后应开展对实验废弃物的消毒，以保护环境及实验人员。选择的消毒方法应简便易于操作，避免使用复杂的消毒方式或影响实验对象的消毒方式。
3.2.1.4确定消毒方法与选择合适的消毒因子，确定的消毒方法应确保其有效性，对健康和环境影响小，使用经卫生行政部门批准或卫生安全评价合格的消毒产品; 此外，由于实验室消毒剂使用量大，必须考虑成本因素，应选择价格相对较低的消毒剂。
3.2.1.5操作人员，一般为实验室操作人员，专门的清洁消毒人员，专门的压力蒸汽灭菌器操作人员等。对方案进行评估等。
3.2.2按制定的消毒灭菌程序或方案进行操作。
3.2.3采取正确的方法进行消毒效果评价、监测。包括消毒效果的实验室评价、模拟现场与现场评价等。
3.2.4根据评价效果改进工作。
4.生物安全实验室的消毒方法
生物安全实验室常用的消毒方法，包括物理消毒法和化学消毒法。
4.1 物理消毒法
4.1.1 热力灭菌法 包括干热灭菌法与湿热灭菌法、干热灭菌法如干热空气灭菌和焚烧灭菌，可用于不耐湿的物品，如不耐湿的粉剂、动物尸体或废弃的污染物品等。但干热空气灭菌法具有热穿透性较差，条件较高的缺点，而焚烧法只有在实验室可以控制焚烧炉的条件下，才能使用。湿热灭菌法主要采用压力蒸汽灭菌器，可适用于耐高温、耐高湿物品的灭菌。
4.1.2 射线消毒法 主要包括紫外线消毒和电离辐射消毒，可对不耐热物品如食品、饲料、塑料制品等有效。应用较多的是紫外线，可用于对实验室空气和实验台面、桌子、椅子、器皿等表面消毒。空气消毒应按房间面积选择安装紫外灯的功率大小和数量，悬吊式紫外灯对室内空气消毒时常用数量为平均1.5W/m3，照射时间不少于30min。使用紫外线消毒时应注意电源电压、照射距离、空气相对湿度和洁净度、温度、有机物、物品材料性质等因素均可影响消毒效果。辐射消毒法，如电离辐射消毒和微波辐射消毒，可用于大量一次性生物制品、医疗用品、食品、药品等的消毒，但操作复杂，成本较高。
4.2化学消毒法
化学消毒剂种类较多。包括过氧化物类( 如过氧乙酸、过氧化氢、过氧戊二酸、臭氧等) 、含氯类消毒剂( 如二氯异氰脲酸钠、次氯酸钠、二氧化氯、含氯清洗消毒剂等) 、含碘消毒剂( 如碘及碘制剂、碘伏消毒剂等) 、醛类消毒剂( 如甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛等) 、环氧乙烷、醇类消毒剂、酚类消毒剂、胍类消毒剂( 如氯己定、聚六亚甲基胍) 、季铵盐等。其中过氧化物类、含氯类、醛类消毒剂属于高效消毒剂，可以应用于细菌芽孢、孢子、分枝杆菌、经血传播病原体(HBV、HIV、HCV等) 等微生物污染的消毒;碘类消毒剂、醇类及醇类复方消毒剂、酚类消毒剂属于中效消毒剂，可以应用于包括真菌、亲水病毒、支原体、衣原体等微生物污染的消毒; 季铵盐、胍类消毒剂属于低效消毒剂，可以应用于包括一般细菌和亲脂病毒等微生物污染的消毒#在具有较多有机物(血清样品)的物品，或微生物污染严重时，应当增加消毒剂量，甚至提高消毒剂应用等级。在选择消毒方法时，还应该根据物品性质，如对于金属器械，应选择基本无腐蚀的消毒剂; 对于光滑表面，可选择紫外线消毒器近距离照射，或液体消毒剂擦拭; 多孔材料表面则应采用喷雾消毒法。
5 消毒技术在生物安全实验室中的应用
5.1 实验室环境与物品消毒
包括地面、实验台面、桌子、椅子、柜子、门把手、实验记录夹等，通常可采用2～5g/L过氧乙酸或有效氯为1～2g/L含氯消毒剂进行喷洒、擦拭消毒，作用时间15min以上。特殊物品如鸡胚表面可使用碘酒和75%乙醇溶液擦拭消毒; 耐热实验器材如玻璃器材、耐热塑料、橡胶、无纺布制品等可采用过氧乙酸或含氯消毒剂浸泡、喷洒作用1h以上，清水洗涤沥干后高压灭菌处理。不耐热塑料器材、橡胶制品等可直接使用5g/L过氧乙酸或2g/L含氯消毒剂浸泡作用1h以上消毒。贵重仪器如显微镜、离心机等局部轻度污染可使用 75%乙醇或醇类复方消毒剂重复擦拭两次以上消毒。污染严重时，可集中采用甲醛熏蒸消毒。
5.2实验室人员消毒
实验室应配备手消毒器，装有75%乙醇或醇类速干消毒剂。工作人员每次实验完毕和离开实验室之前按作用时间和使用方法进行手消毒。个人防护装备如防护服表面可通过小型喷雾器喷洒 75%乙醇进行消毒; 可回收眼罩、面具使用200mg/L二氧化氯或1000mg/L含氯消毒剂浸泡作用30min。
5.3实验室污染的随时消毒。
5.3.1实验时一旦发生微生物污染地面或实验台面，应立即停止实验，进行消毒处理。可首先使用含氯吸湿材料覆盖，根据目标微生物选择喷洒有效氯5000mg/L含氯消毒剂或过氧乙酸溶液消毒作用30min，小心将吸湿材料与实验样品、液体一起放入耐高压污物袋中。
5.3.2离心管发现或怀疑破损后，应关闭机器电源，密闭静置30min 。破碎离心管、玻璃碎片、十字轴和转子应放在75%乙醇或醇复合制剂中浸泡24h后进行压力蒸汽灭菌。离心机内腔使用 75%乙醇或醇复合制剂反复擦拭两次以上，用水擦洗干净并干燥。清理时所有材料按感染性废弃物处置。
5.4生物安全柜的消毒。
生物安全柜的常规消毒方式主要采用紫外灯照射和消毒剂擦拭，可根据目标微生物选择含氯消毒剂或75%乙醇或醇复合制剂，在每次使用前后进行工作台面和内壁的擦拭消毒，开启紫外灯照射消毒30min。但该方法无法彻底清除潜在的污染。因此，当污染事故发生、生物安全柜移动以及更换过滤器之前，必须进行生物安全柜内表面和空间的消毒，及时清除污染，防止实验室内感染事件发生。通常可采用过氧化氢蒸汽雾(VHP)法进行消毒。使用VHP发生器，选择12ml/L喷雾量(30%的过氧化氢），密闭消毒作用120min，即可对生物安全柜、隔
离笼、换笼机内不同部位表面染菌布片上的枯草杆菌黑色变种芽孢达到良好的消毒效果，对物品无腐蚀，对人体、环境无残留毒性。
5.2排风高效过滤器(HEPA) 的原位消毒
BSL-2实验室核心区排风HEPA过滤器是保证实验操作过程中产生的感染性气溶胶不外泄的最后防线，为了保障环境安全，需要在原位实现 HEPA过滤 器 的 消 毒。通 常 可 采 用 过 氧 化 氢 蒸 汽 雾(VHP) 法进行消毒。消毒器应与排风HEPA过滤器排风箱体的消毒接口连接，利用循环气流带动蒸汽循环实现原位消毒。消毒后可将HEPA滤器卸载，装入医用废物塑料袋中，进行压力蒸汽法灭菌后焚烧。
5.6实验室终末消毒
当一阶段的实验完成后，准备进行下一阶段的实验时，需要进行实验室终末消毒。实验室内所有物品均应经消毒后才能移出实验室外，可根据物品性质选择物理或化学消毒法进行处理。实验室物体表面可采用擦拭消毒法，也可通过空气、物表一体化的喷雾、熏蒸法进行处理。甲醛熏蒸对人有毒性和刺激性，且作用时间长，应当慎重选择。过氧化氢汽雾法可使用≥12ml/m3喷雾量(30%的过氧化氢) ，密闭消毒作用60min，即可达到消毒效果，且对不锈钢、碳钢、铜、铝等四种金属均无腐蚀，对彩钢板墙面也无明显腐蚀作用。
5.7 实验室废弃物的消毒处理
根据GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》，BSL-2实验室操作中产生的感染性废弃物应经过压力蒸汽灭菌后方可运离防护区，然后按感染性废物收集处理。在实际操作过程中，应注意以下几点:
5.7.1实验操作中产生的废弃物进行化学消毒时，应尽量避免采用氧化性和刺激性强的消毒剂，液体废弃物还应考虑液体对消毒剂的稀释作用。
5.7.2实验结束后，首先将感染性废弃物放入包装内密封，放入固体废弃物收集容器，以保证生物安全; 在做好个人防护情况下，于压力蒸汽灭菌前适当松开包装袋口，以达到灭菌效果。
5.7.3使用硬质、防漏且耐高温高压的容器盛装液体感染性废弃物; 实验结束后，容器封口方可以出生物安全柜，但在压力蒸汽灭菌前应适当松开容器口; 液体感染性废弃物灭菌时，不能采用真空模式，以防灭菌的液体被抽离灭菌器内室，对管道造成损害。
5.7.4动物尸体或器官灭菌时，也不宜采用真空模式，应采用缓慢进、排气方式。
