一、细胞传代
1. 仪器：
生物安全柜、CO2细胞培养箱、倒置显微镜、体视显微镜（细胞计数用）、水浴锅、计时器、离心机、托盘天平（配平用）。
2. 耗材：
移液枪、电动移液器、血细胞计数板；
5ml无菌吸管、10ml无菌吸管、无菌枪头、无菌细胞瓶、废液缸。
3. 试剂及配置：
PBS：用800ml超纯水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.628g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4。用1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
胰酶消化液：称取胰酶（1：250）2.5g，EDTA-Na 0.3g，NaCl 8.0g,KCl 0.4g,葡萄糖（Glucose）1.0g,苯酚红（Phenol Red）0.005g,用1L超纯水溶解，磁力搅拌2-3h，调pH至7.8-8.0，经0.22μm过滤后，4℃（短期贮存）或-20℃（长期贮存）保存。
台盼蓝：先制备出4%台盼蓝母液，称取4g台盼蓝加少量超纯水研磨，加水至100ml，滤纸过滤，4℃保存。临用时，用PBS（pH 7.4）稀释母液至0.4%即可。
含10%NCS（Newborn Calf Serum，新生牛血清，GIBCO）的DMEM培养基：取DMEM 粉1袋，加入990ml超纯水溶解，加入3.7g NaHCO3，搅拌2h，加入三抗10ml，经0.22μm过滤后，即配成1L无血清DMEM。用900ml无血清DMEM与100ml NCS混匀后经0.22μm过滤后，即配成含10%NCS的DMEM培养基。4℃贮存。
4. 实验步骤：
4.1 贴壁性不强的细胞（如sp2/0细胞）的传代：
1）将含10%NCS的DMEM培养基置于37℃水浴锅中预热。
2）观察细胞，选取健康、长成单层的细胞进行细胞传代。
3）在生物安全柜中，用吸管吸出瓶中的旧上清液，转移到废液缸中。
4）加入等体积新的培养基。
5）旋紧瓶盖，用手轻轻拍打瓶壁，使细胞从瓶壁上脱落下来。当瓶壁上的细胞完全脱落后（即瓶壁由模糊不清变得完全透明），用吸管轻轻吹打混匀细胞，用移液枪吸出20μl进行细胞计数。
6） 根据计数结果算出细胞总数，然后加入适量培养基，将细胞稀释成1×105/ml的密度，将细胞悬液吹打混匀后按适当的量分装于无菌细胞瓶中，置于37℃、5%CO2条件下培养。
4.2 贴壁性强的细胞（如Marc145细胞）的传代：
1）将含10%NCS的DMEM培养基和PBS置于37℃水浴锅中预热。
2）观察细胞，选取健康、长成单层的细胞进行细胞传代。
3）在生物安全柜中，用吸管吸出瓶中的旧上清液，转移到废液缸中。
4）加入等体积PBS，用吸管反复吹打瓶壁5次。
5）用吸管吸出瓶中的PBS，转移到废液缸中。加入适量胰酶消化液（一般35cm2细胞瓶加入1ml），置于37℃孵育3分钟，再将细胞瓶翻转，37℃孵育2分钟后取出。这时在倒置显微镜下观察细胞应该出现圆缩且彼此分离，这说明已消化完全。
6）弃掉胰酶消化液，每瓶加入10ml含10%NCS的DMEM培养基（35cm2细胞瓶），用吸管轻轻吹打混匀细胞，用移液枪吸出20μl进行细胞计数。
7）根据计数结果算出细胞总数，然后加入适量培养基，将细胞稀释成1×105/ml的密度，将细胞悬液吹打混匀后按适当的量分装于无菌细胞瓶中（每瓶细胞数最少为106个），置于37℃、5%CO2条件下培养。
5. 注意事项：
1）避免支原体等外源因子的感染。
2）培养液的pH值可在范围为7.0－7.3，以7.2为佳。
3）培养基和血清的质量要可靠、稳定。
4）细胞必须及时传代（一般隔一天传代一次，不过因细胞而定）。
整理人：张振杰 审校人：李娟
二、细胞冻存
1. 仪器：
生物安全柜、CO2细胞培养箱、倒置显微镜、体视显微镜（细胞计数用）、计时器、离心机、托盘天平（配平用）。
2. 耗材：
移液枪、电动移液器、血细胞计数板；
5ml无菌吸管、10ml无菌吸管、无菌枪头、无菌15ml离心管、废液缸、2ml无菌冻存管、冻存盒、乙醇。
3. 试剂及配置：
PBS：用800ml超纯水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.628g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4。用1mol/L HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
胰酶消化液：称取胰酶（1：250）2.5g，EDTA-Na 0.3g，NaCl 8.0g,KCl 0.4g,葡萄糖（Glucose）1.0g,苯酚红（Phenol Red）0.005g,用1L超纯水溶解，磁力搅拌2-3h，调pH至7.8-8.0，经0.22μm过滤后，4℃（短期贮存）或-20℃（长期贮存）保存。
台盼蓝：先制备出4%台盼蓝母液，称取4g台盼蓝加少量超纯水研磨，加水至100ml，滤纸过滤，4℃保存。临用时，用PBS（pH 7.4）稀释母液至0.4%即可。
含10%NCS（Newborn Calf Serum，新生牛血清，GIBCO）的DMEM培养基：取DMEM 粉1袋，加入990ml超纯水溶解，加入3.7g NaHCO3，搅拌2h，加入三抗10ml，经0.22μm过滤后，即配成1L无血清DMEM。用900ml无血清DMEM与100ml NCS混匀后经0.22μm过滤后，即配成含10%NCS的DMEM培养基。4℃贮存。
细胞冻存液：取7ml无血清DMEM，2ml NCS（Newborn Calf Serum，新生牛血清，GIBCO），1ml DMSO，混匀后经0.22μm过滤后，即配成细胞冻存液。现用现配。
4. 实验步骤：
1）观察细胞，选取健康、对数生长期的细胞进行细胞冻存。
2）贴壁性强的细胞，用胰酶消化液消化下来并用含10%NCS的DMEM培养基重悬；贴壁性不强的细胞，轻轻拍打瓶壁使细胞脱落。
3）用吸管吹打混匀后，进行细胞计数。计算出细胞总数。
4）将细胞悬液分装于15ml离心管中，300g离心10min。
5）弃掉上清液，加入适量细胞冻存液，将细胞重悬稀释成2.5×106/ml的密度，用吸管吹打混匀。
6）用1ml移液枪将细胞悬液分装到2ml无菌冻存管中，1ml/管。在管上标明细胞系、代数、冻存人和日期。用封口膜封好管口。
7）将冻存管放于装有无水乙醇的冻存盒中，注意无水乙醇液面应高于细胞悬液液面但应低于冻存管管口。
8）将冻存盒于-80℃放置24h。
9）24h后，取出冻存盒，将冻存管放于液氮中长期保存。记录好冻存的细胞系、代数、位置、时间和冻存人。
5. 注意事项：
1）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90％，无微生物污染。
2）使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏。目前，最常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5－10％。但是，有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油（glycele）,羟乙基淀粉等。
3）DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
整理人：张振杰 审校人：周宏
三、TCID50
1. 测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
2. 材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）、
6、海门96孔细胞培养板
3. TCID50的操作步骤
（1） 铺板，将胰酶消化好的Marc145细胞调整密度为1×105个/毫升 ，加到96空细胞培养板中，175ul/well.大约24小时长成单层.
（2） 在海门96空细胞培养板中用无血清的DMEM培养基将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
（3） 将稀释好的病毒接种到Marc145单层细胞上，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。，正常细胞对照作两纵排。
（4） 逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
（5） 结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
4. TCID50的计算方法
（1） Reed-Muench两氏法
病毒液稀释度 |
出现CPE孔数 |
无CPE孔数 |
累 计 |
出现CPE孔所占的% |
CPE孔数 |
无CPE孔数 |
10-1 |
8 |
 0
|
27 |
0 |
100（27/27） |
10-2 |
8 |
0 |
19 |
0 |
100（19/19） |
10-3 |
7 |
1 |
11 |
1 |
91.6 （11/12） |
10-4 |
3 |
5 |
4 |
6 |
40（4/10） |
10-5 |
1 |
7 |
1 |
13 |
0.7（1/14） |
10-6 |
0 |
8 |
0 |
21 |
0（0/21） |
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
（2） Karber法
病毒液稀释度 |
出现CPE的孔数 |
出现CPE孔的比率 |
10-1 |
8 |
8/8=1 |
10-2 |
8 |
8/8=1 |
10-3 |
7 |
7/8=0.875 |
10-4 |
3 |
3/8=0.375 |
10-5 |
1 |
1/8=0.125 |
10-6 |
0 |
0/8=0 |
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
参考文献：病毒学
