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Western Bolt和IFA(SOP)

作者:病原所时间:2017-12-13点击数:

一、Western Blot实验技术

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测。

1.原理

Western Blot是将表达的蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

2. 试剂准备

(1)SDS-PAGE试剂(见SDS-PAGE凝胶电泳)

(2)转移缓冲液(电转液):甘氨酸 14.4g;Tris-Base 3.03g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。

(3)洗脱液(PBST):0.5%Tween-20的PBS溶液(V/V)

(4)封闭液(2.5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉2.5g 溶于100ml的PBST中。

(5)显色液:增强型HRP-DAB 底物显色试剂盒(TIANGEN)

3. 操作步骤

(一)蛋白质样品电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE(见SDS-PAGE凝胶电泳)。

(二)转移:(半干式转移)

1、电泳结束后将胶条割至合适大小(去除积层胶),用转膜缓冲液平衡(浸入电转液)。

2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,将膜先浸入甲醇中(完全覆盖)然后转入电转液中,滤纸直接浸入电转液中。

3、转膜:采用BIO-RAD转膜装置,由下到上依次为滤纸(2张)、NC膜、凝胶、滤纸(2张)顺序放好,去除气泡。接通电源,20V。蛋白质分子量大小与转膜时间的关系如下:20KDa——20-25min,30-35KDa——30-40min。

(三)免疫反应:

1、转膜完毕后,将膜小心取出,封闭液4℃封闭过夜(缓慢摇动)。

2、弃封闭液,用洗脱液洗膜,10min ×3次(摇床上剧烈振荡)。

3、加入一抗(按合适稀释比例用封闭液稀释),室温孵育2h。 设立阴性、阳性对照。

4、弃一抗,用洗脱液洗膜,10min×3次。
5、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用封闭液稀释),平稳摇动,室温孵育2h。

6、弃二抗,用洗脱液洗膜,10min×3次,然后用PBS洗膜10min。

7、加入显色液,避光显色至出现目的条带时(5-20min),放入双蒸水中终止反应。室温干燥后,观察结果。

4. 注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。一般情况:二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例,一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。

2、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验,对照分为:阳性对照(最好有标准品(阳性血清);阴性对照(测血时用相应小鼠未免疫血清即正常血);空白对照(不加一抗,用PBS代替);无关对照(用无关抗体)

3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样,尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件,尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。

4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果,要特别注意几点:凝胶要均一没有气泡;积层胶与分离胶界面要水平;AP和TEMED的量不能过多,太多会导致胶易脆裂;拔梳子时要快,尽量保证点样孔平整。

5、电泳、转膜时特别要注意正负极,电压电流都不能过高;转膜时“三明治”的叠放次序不错,同时要防止产生气泡。

6、加一抗二抗要严格保证反应时间,洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;还要注意一抗二抗的匹配。

7、在显色时要特别注意二抗所对应的显色方法,特别是在显影时要注意显影时间的控制,以看得清楚目的条带为标准。

8、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。

9、整个实验过程中,要保持膜的湿润。


整理人:周宏    校阅人:李娟


二、IFA间接免疫荧光

1. 仪器耗材:96-well细胞板,荧光显微镜,一抗(多为血清或者单抗),荧光标记的二抗(根据需要选择)

2. PBS的配制:Sodium Chloride(NaCl):8.5 g;Sodium Phosphate Dibaasic(磷酸氢二钠):1.33 g;Sodium Phosphate Monobasic(磷酸二氢钠):0.22 g;Distilled water, QS to 1 liter

3. 实验步骤:

(1) 铺板:将Marc-145细胞以1×105个/ml的密度加到96-well细胞板上,每孔175ul,大约24小时后细胞长成单层。

(2) 取10个无菌的1.5ml的离心管,各加入400ul的含10%小牛血清的DMEM。

(3) 标记好分别在加有400ul的10%小牛血清的DMEM的离心管中加入400ul的病毒原液,将混合好的液体加入96孔板中,每孔加入150ul。

(4) 培养19-24小时等细胞稍出现CPE现象,将毒液弃掉,加入200ul的75%乙醇 (需放在-20℃预冷)放在4℃ 固定30min。{80%丙酮固定10—15min}

(5) 弃掉固定液在生物安全柜中吹干(大约20min)。

(6) 根据适当的稀释度每孔加入血清(一抗)100ul,37℃作用1h。

(7) PBS洗5min×4次。

(8) 每孔加入100ul适当稀释倍数的荧光标记的二抗。

(9) 避光37℃作用1h。

(10)PBS洗5min×4次。

(11)四蒸水洗10min×1次。

(12)去掉水,避光干燥后镜检。

4. 注意事项

(1)可以用80%的丙酮固定。(2)加入二抗后需避光保存。(3)二抗的选择 特别注意看清标记,选择符合条件的二抗。(4)荧光标记二抗需低温避光保存,使用二抗时应取完后立刻放回。

整理人:周宏       审校人:李娟





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